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操作步骤

1. 准备工作：将试剂盒从冰箱中取出，恢复至室温（一般为 20 - 25℃）。按照说明书的要求配制洗涤液、样本稀释液等。采集小鼠的血清、血浆、组织匀浆或细胞培养上清等样本，离心去除杂质，如有必要，可对样本进行适当稀释。
2. 加样：将标准品和待测样本加入到相应的微孔中，同时设置空白对照孔。加样时应使用准确的移液器，避免交叉污染，轻轻振荡混匀，然后在规定的温度（如 37℃）和时间（通常为 1 - 2 小时）下孵育，使样本中的 NPHN 与包被抗体充分结合。
3. 洗涤：孵育结束后，弃去孔内液体，用洗涤液洗涤微孔板数次，每次浸泡一段时间（如 3 - 5 分钟）后拍干，以去除未结合的抗原、抗体及其他杂质。
4. 加酶标工作液：向每孔加入适量的酶标工作液，轻轻振荡混匀，然后在规定条件下（如 37℃，1 - 2 小时）孵育，使酶标抗体与已结合在包被抗体上的 NPHN 特异性结合。
5. 洗涤：重复洗涤步骤，以 去除未结合的酶标抗体，减少背景干扰。
6. 显色：加入底物溶液，轻轻振荡混匀，在避光条件下孵育（如 37℃，15 - 30 分钟），让酶催化底物发生显色反应，颜色会随着 NPHN 含量的增加而加深。
7. 终止反应：加入终止液，轻轻振荡混匀，终止显色反应。此时，蓝色产物会迅速变为黄色。
8. 读数：使用酶标仪在特定波长下（如 450nm）测定各孔的吸光度值。根据标准品的浓度和对应的吸光度值绘制标准曲线，然后根据样本的吸光度值从标准曲线上计算出样本中 NPHN 的浓度。

注意事项

1. 试剂盒应在 2 - 8℃保存，避免受热、受潮或阳光直射，使用前应检查试剂盒是否在有效期内，以及试剂盒中的各组分是否有变质、变色等异常情况。
2. 实验操作过程中要严格按照说明书进行，使用准确的移液器，并及时更换吸头，避免交叉污染。加样要准确、快速，避免加样量不准确或加样时间过长导致样本蒸发或反应不均匀。
3. 洗涤过程是保证检测准确性的关键步骤，要充分洗涤以去除未结合的物质，但也要注意避免过度洗涤导致已结合的物质被洗脱，影响检测结果。洗涤液应使用新鲜配制的，且要用高质量的去离子水或蒸馏水。
4. 显色反应需在避光条件下进行，可将酶标板放在不透光的盒子中或用铝箔纸包裹，以防止底物溶液在光照下自行分解，影响显色效果。底物溶液应在使用前新鲜配制，避免长时间放置导致底物失效。
5. 酶标仪的波长设置要准确，读数时间要按照说明书的要求进行，一般在加入终止液后 15 - 30 分钟内完成读数，以确保结果的准确性。在测定吸光度值前，要确保酶标板表面清洁，无残留液体和污渍，以免影响读数。
6. 对于浓度过高或过低的样本，应进行适当的稀释或浓缩，稀释倍数要根据样本的预估浓度和试剂盒的检测范围合理选择，并在报告结果时注明稀释倍数。同时，要注意稀释后的样本基质是否会对检测结果产生影响，如有必要，可进行基质校正。
7. 实验过程中要注意个人防护，避免试剂接触皮肤和眼睛，如不慎接触，应立即用大量清水冲洗，并及时就医。同时，要妥善处理试剂盒中的废弃物，按照生物安全的要求进行分类处理，避免对环境造成污染。